小鼠白細(xì)胞介素20(IL-20)ELISA檢測試劑盒一步法測定原理

試劑盒采用雙抗體一步夾心法酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）。往預(yù)先包被小鼠白細(xì)胞介素20(IL-20)捕獲抗體的包被微孔中，依次加入標(biāo)本、標(biāo)準(zhǔn)品、HRP標(biāo)記的檢測抗體，經(jīng)過溫育并洗滌。用底物TMB顯色，TMB在過氧化物酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成最終的黃色。顏色的深淺和樣品中的小鼠白細(xì)胞介素20(IL-20)呈正相關(guān)。用酶標(biāo)儀在450nm 波長下測定吸光度（OD 值），計(jì)算樣品濃度.

ELISA（酶聯(lián)免疫吸附測定）是一種基于多孔板的免疫測定法,將通常作為檢測成分之一的抗體或樣品吸附在固體表面（此方法采多孔板）.ELISA以相對低廉的成本,快速 定量且靈敏地檢測分析物,是容易的分析方法之一.此外,ELISA還可輕松改造為更高通量篩選方法,幫助研究人員通過單次運(yùn)行檢測大量樣品.夾心法 直接法和競爭法ELISAs

我們的ELISA采用簡單易用的方法,可用于研究血清 血漿 細(xì)胞培養(yǎng)上清液或裂解液等各種基質(zhì)中的可溶性蛋白標(biāo)志物.包括1000多種“僅供研究使用"的檢測試劑盒,適用的樣本類型包括人 小鼠 大鼠等各種動(dòng)物模型（如農(nóng)業(yè)和伴生動(dòng)物）.每份試劑盒都提供特定實(shí)驗(yàn)方案及96孔板所需的試劑.ELISA試劑盒主要為96孔規(guī)格,目標(biāo)物檢測和定量所需試劑都由廠商提供.采用夾心法 直接法和競爭法等各種ELISA方法.

夾心法使用針對同一目標(biāo)抗原不同表位的一對單克隆抗體(mAb).固定在微孔板中的一抗,用于將蛋白從溶液中提取出來.二抗則用于完成“夾心",提供表示目標(biāo)抗原存在的信號.試劑盒提供重組形式的已知含量的抗原蛋白,方便用戶建立標(biāo)準(zhǔn)曲線解析樣品信號.我們大部分產(chǎn)品采用的都是這種夾心法ELISA.

直接法和競爭法比較少見.直接法先用一種單抗檢測固定在微孔板上的樣品.然后一抗會與的酶標(biāo)二抗結(jié)合提供信號.

競爭法在微孔板上預(yù)包被已知含量的生物標(biāo)志物.酶標(biāo)抗體與樣品共同孵育,并與預(yù)包被抗體進(jìn)行“競爭性"結(jié)合反應(yīng),具體結(jié)果取決于樣品中目標(biāo)物的濃度.于是游離抗體能與微孔板上的抗原結(jié)合,并在樣品洗去后呈現(xiàn)信號.該信號與目標(biāo)標(biāo)志物的濃度成反比.

需自備的設(shè)備及試劑： 

1. 450±10nm 濾光片酶標(biāo)儀

2. 高精度加樣器及槍頭：0.5-10uL、2-20uL、20-200uL、200-1000uL.

3. Eppendorf 移液器.

4. 蒸餾水或去離子水.

5. 脫脂棉吸水紙.

6. 37℃恒溫箱.

8. 準(zhǔn)備若干個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品稀釋管.

樣本處理及要求：

1. 血清：將收集于血清分離管的全血標(biāo)本在室溫放置2小時(shí)或4℃過夜，然后1000×g離心20分鐘，取上清即可，或?qū)⑸锨逯糜?20℃或-80℃保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融。

2. 血漿：用EDTA或肝素作為抗凝劑采集標(biāo)本，并將標(biāo)本在采集后的30分鐘內(nèi)于2-8℃1000×g離心15分鐘，取上清即可檢測，或?qū)⑸锨逯糜?20℃或-80℃保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融。

3. 組織勻漿：用預(yù)冷的PBS (0.01M, pH=7.4)沖洗組織，去除殘留血液（勻漿中裂解的紅細(xì)胞會影響測量結(jié)果），稱重后將組織剪碎。將剪碎的組織與對應(yīng)體積的PBS（一般按1:9的重量體積比，比如1g的組織樣品對應(yīng)9mL的PBS，具體體積可根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要適當(dāng)調(diào)整，并做好記錄。推薦在PBS中加入蛋白酶抑制劑）加入玻璃勻漿器中，于冰上充分研磨。為了進(jìn)一步裂解組織細(xì)胞，可以對勻漿液進(jìn)行超聲破碎，或反復(fù)凍融。最后將勻漿液于5000×g離心5~10分鐘，取上清檢測。

4. 細(xì)胞培養(yǎng)物上清：請1000×g離心20分鐘，取上清即可檢測，或?qū)⑸锨逯糜?20℃或-80℃保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融。

5. 其它生物標(biāo)本：1000×g離心20分鐘，取上清即可檢測。

6. 樣品外觀：樣品應(yīng)清澈透明，懸浮物應(yīng)離心去除。

7. 樣品保存：樣品收集后若在1周內(nèi)進(jìn)行檢測的可保存于4℃，若不能及時(shí)檢測，請按一次使用量分裝，凍存于-20℃（1個(gè)月內(nèi)檢測），或-80℃（6個(gè)月內(nèi)檢測），避免反復(fù)凍融，標(biāo)本溶血會影響最后檢測結(jié)果，因此溶血標(biāo)本不宜進(jìn)行此項(xiàng)檢測。